現(xiàn)在，二十多年過(guò)去了，MIT教授Jonathan Weissman及其同事已經(jīng)超越了序列并提出了人類(lèi)細(xì)胞中表達(dá)的基因的第一個(gè)全面功能圖。這個(gè)項(xiàng)目的數(shù)據(jù)于6月9日在線發(fā)表在《Cell》上，其將每個(gè)基因跟它在細(xì)胞中的工作聯(lián)系起來(lái)，這代表了多年來(lái)在單細(xì)胞測(cè)序方法Perturb-seq上合作的結(jié)晶。

這些數(shù)據(jù)可供其他科學(xué)家使用。Weissman說(shuō)道：”這是一個(gè)很大的資源，就像人類(lèi)基因組是一個(gè)很大的資源一樣，你可以進(jìn)去做基于發(fā)現(xiàn)的研究。你不必提前定義你要研究的生物學(xué)，你有這個(gè)基因型-表型關(guān)系圖，你可以進(jìn)去篩選數(shù)據(jù)庫(kù)，而不必做任何實(shí)驗(yàn)。”據(jù)悉，他還是懷特海研究所的成員和霍華德-休斯醫(yī)學(xué)研究所的調(diào)查員。

這使得研究人員得以深入研究各種生物學(xué)問(wèn)題。他們用它來(lái)探索功能未知的基因?qū)?xì)胞的影響、研究線粒體對(duì)壓力的反應(yīng)并篩選出導(dǎo)致染色體丟失或增加的基因，這種表型在過(guò)去被證明很難研究。“我認(rèn)為這個(gè)數(shù)據(jù)集將使那些來(lái)自生物學(xué)其他領(lǐng)域的人能夠進(jìn)行各種我們甚至還沒(méi)有想到的分析，突然間他們就有了這個(gè)可以利用的東西，”這項(xiàng)研究的論文共同第一作者、前魏斯曼實(shí)驗(yàn)室博士后Tom Norman說(shuō)道。

開(kāi)創(chuàng)性Perturb-seq方法

該項(xiàng)目利用的Perturb-seq方法使得科學(xué)家們有可能以前所未有的深度跟蹤開(kāi)啟或關(guān)閉基因的影響。這種方法由包括魏斯曼和MIT教授Aviv Regev在內(nèi)的一組研究人員于2016年首次發(fā)表，不過(guò)它只能用于小規(guī)模的基因集且花費(fèi)巨大。

大量的Perturb-seq圖譜是由Joseph Replogle的基礎(chǔ)工作促成，他是Weissman實(shí)驗(yàn)室的醫(yī)學(xué)博士生，也是本論文的第一作者之一。Replogle與Norman、Britt Adamson（普林斯頓大學(xué)分子生物學(xué)系的助理教授）及10x基因組學(xué)的一個(gè)小組合作著手創(chuàng)建一個(gè)可以擴(kuò)大規(guī)模的新版Perturb-seq。研究人員于2020年在《Nature Biotechnology》上發(fā)表了一篇概念驗(yàn)證的論文。

Perturb-seq方法使用CRISPR-Cas9基因組編輯將遺傳變化引入細(xì)胞，然后使用單細(xì)胞RNA測(cè)序來(lái)捕獲有關(guān)因特定遺傳變化而表達(dá)的RNA的信息。由于RNA控制著細(xì)胞行為方式的所有方面，這種方法可以幫助解讀基因變化的許多細(xì)胞效應(yīng)。

自他們最初的概念驗(yàn)證論文以來(lái)，Weissman、Regev及其他人已經(jīng)在更小的范圍內(nèi)使用這種測(cè)序方法。如研究人員在2021年使用Perturb-seq來(lái)探索人類(lèi)和病毒基因在感染HCMV（一種常見(jiàn)的皰疹病毒）的過(guò)程中如何互動(dòng)。

在新研究中，Replogle和包括Weissman實(shí)驗(yàn)室的研究生和該論文的共同第一作者Reuben Saunders在內(nèi)的合作者將該方法擴(kuò)大到整個(gè)基因組。他使用人類(lèi)血癌細(xì)胞系以及來(lái)自視網(wǎng)膜的非癌細(xì)胞、對(duì)超過(guò)250萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了Perturb-seq并利用這些數(shù)據(jù)建立了一個(gè)將基因型和表型聯(lián)系起來(lái)的全面地圖。

深入研究數(shù)據(jù)

在完成篩選后，研究人員決定將他們的新數(shù)據(jù)集投入使用并著手研究一些生物學(xué)問(wèn)題。Tom Norman指出：“Perturb-seq的優(yōu)勢(shì)在于它可以讓你以一種無(wú)偏見(jiàn)的方式獲得一個(gè)大數(shù)據(jù)集。沒(méi)有人完全知道你能從這種數(shù)據(jù)集中得到的極限是什么。現(xiàn)在問(wèn)題是，你實(shí)際上用它做什么？”

第一個(gè)最明顯的應(yīng)用是研究具有未知功能的基因。因?yàn)樵撈聊灰沧x出了許多已知基因的表型，研究人員可以用這些數(shù)據(jù)來(lái)比較未知基因和已知基因并尋找類(lèi)似的轉(zhuǎn)錄結(jié)果，這可能表明這些基因產(chǎn)品作為一個(gè)更大的復(fù)合物的一部分一起工作。

一個(gè)名為C7orf26的基因的突變尤其引人注目。研究人員注意到，那些被移除導(dǎo)致類(lèi)似表型的基因是一種叫做Integrator的蛋白質(zhì)復(fù)合物的一部分，該復(fù)合物在創(chuàng)造小核糖核酸方面起著作用。Integrator復(fù)合體由許多較小的亞單元組成--以前的研究表明有14個(gè)單獨(dú)的蛋白質(zhì)--而研究人員能確認(rèn)C7orf26構(gòu)成了該復(fù)合體的第15個(gè)組成部分。

他們還發(fā)現(xiàn)，這15個(gè)亞單位在較小的模塊中一起工作并在整合者復(fù)合物中執(zhí)行特定的功能。Saunders說(shuō)道：“如果沒(méi)有這種千尺高樓平地起的情況，這些不同的模塊在功能上是如此不同，這一點(diǎn)并不清楚。”

而Perturb-seq的另一個(gè)好處是，由于該檢測(cè)專(zhuān)注于單細(xì)胞，研究人員可以使用這些數(shù)據(jù)來(lái)觀察更復(fù)雜的表型，當(dāng)它們跟來(lái)自其他細(xì)胞的數(shù)據(jù)一起研究時(shí)這些表型會(huì)變得模糊不清。“我們經(jīng)常把‘基因X’被敲除的所有細(xì)胞拿出來(lái)，把它們平均在一起，然后看看它們?nèi)绾巫兓盬eissman介紹稱(chēng)，“但有時(shí)當(dāng)你敲除一個(gè)基因時(shí)，失去同一基因的不同細(xì)胞會(huì)有不同的行為，而這種行為可能會(huì)被平均數(shù)所忽略。”

相關(guān)資料圖

研究人員發(fā)現(xiàn)，一個(gè)基因子集，其去除導(dǎo)致不同細(xì)胞的不同結(jié)果，負(fù)責(zé)染色體的分離。它們的移除導(dǎo)致細(xì)胞失去一條染色體或撿到一條額外的染色體，這種情況被稱(chēng)為非整倍體。“你無(wú)法預(yù)測(cè)失去這個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是什么，因?yàn)樗Q于你獲得或失去什么染色體的次級(jí)效應(yīng)，”Weissman介紹道，“我們意識(shí)到，我們可以扭轉(zhuǎn)這種情況，創(chuàng)造這種復(fù)合表型，尋找染色體獲得和失去的特征。通過(guò)這種方式，我們已經(jīng)完成了第一個(gè)全基因組范圍的篩選以尋找DNA正確分離所需的因素。”

“我認(rèn)為非整倍體研究是迄今為止這一數(shù)據(jù)的最有趣的應(yīng)用。它抓住了一個(gè)你只能用單細(xì)胞讀出的表型。你不能用其他方式去追求它，”Norman說(shuō)道。

研究人員還利用他們的數(shù)據(jù)集來(lái)研究線粒體如何對(duì)壓力做出反應(yīng)。從自由生活的細(xì)菌進(jìn)化而來(lái)的線粒體，在其基因組中攜帶13個(gè)基因。在核DNA內(nèi)，約有1000個(gè)基因跟線粒體功能有某種程度的關(guān)系。Replogle說(shuō)道：“人們對(duì)核DNA和線粒體DNA在不同的細(xì)胞條件下是如何協(xié)調(diào)和調(diào)節(jié)的，特別是當(dāng)一個(gè)細(xì)胞受到壓力時(shí)，已經(jīng)關(guān)注了很久了。”

研究人員發(fā)現(xiàn)，當(dāng)他們擾亂不同的線粒體相關(guān)基因時(shí)，核基因組對(duì)許多不同的遺傳變化作出類(lèi)似的反應(yīng)。然而線粒體基因組的反應(yīng)要多得多。

Replogle指出：“線粒體為什么仍有自己的DNA，這仍然是一個(gè)開(kāi)放的問(wèn)題。從我們的工作中得到的一個(gè)大的啟示是，擁有獨(dú)立的線粒體基因組的一個(gè)好處可能是對(duì)不同的壓力源有局部的或非常具體的遺傳調(diào)節(jié)。”

“如果你有一個(gè)線粒體被破壞，而另一個(gè)線粒體以不同的方式被破壞，這些線粒體可能會(huì)做出不同的反應(yīng)，”Weissman說(shuō)道。

在未來(lái)，研究人員希望將Perturb-seq用于他們開(kāi)始使用的癌細(xì)胞系以外的不同類(lèi)型的細(xì)胞。另外，他們還希望繼續(xù)探索他們的基因功能圖并希望其他人也能這樣做。Norman說(shuō)道：”這確實(shí)是作者和其他合作者多年工作的結(jié)晶，我真的很高興看到它繼續(xù)成功和擴(kuò)大。”